simplified schematic design for cytogenetic testing strategies

The development of new genetic diagnostic, and hence therapeutic possibilities, has brought the realization that genetic disease is now an integral part of medical practice. Advances in cytogenetic and molecular testing have drastically improved the ability to diagnose with certainty many previously unrecognized genetic diseases. However, this advance in technology does not come without new questions. New tests are not always the most cost-effective ones and some have significant diagnostic limitations. Genetic tests fall under three major categories: chromosomal genetic tests; molecular genetic tests [DNA and gene tests]; and biochemical genetic tests [measuring the amount and activity of proteins]. This review article focuses on chromosomal anomalies and cytogenetic tests. The different types of cytogenetic tests, their indications, and the advantages and disadvantages of each of them are discussed. This review will also present the strategy of choice for each one of these tests depending on the type of chromosomal anomalies that we are searching for and the available specimen for diagnosis. Chromosomal anomalies represent one of the entities of genetic diseases. A large number of cytogenetic tests exist for diagnosis of these chromosomal anomalies. However, the choice of cytogenetic test to be carried out should be based on clinical indications, on the type and size of cytogenetic anomaly that we are searching for, and on the available specimen for diagnosis

Genomic alterations detected by comparative genomic hybridization in ovarian endometriomas

Endometriosis is a complex and multifactorial disease. Chromosomal imbalance screening in endometriotic tissue can be used to detect hot-spot regions in the search for a possible genetic marker for endometriosis. The objective of the present study was to detect chromosomal imbalances by comparative genomic hybridization (CGH) in ectopic tissue samples from ovarian endometriomas and eutopic tissue from the same patients. We evaluated 10 ovarian endometriotic tissues and 10 eutopic endometrial tissues by metaphase CGH. CGH was prepared with normal and test DNA enzymatically digested, ligated to adaptors and amplified by PCR. A second PCR was performed for DNA labeling. Equal amounts of both normal and test-labeled DNA were hybridized in human normal metaphases. The Isis FISH Imaging System V 5.0 software was used for chromosome analysis. In both eutopic and ectopic groups, 4/10 samples presented chromosomal alterations, mainly chromosomal gains. CGH identified 11q12.3-q13.1, 17p11.1-p12, 17q25.3-qter, and 19p as critical regions. Genomic imbalances in 11q, 17p, 17q, and 19p were detected in normal eutopic and/or ectopic endometrium from women with ovarian endometriosis. These regions contain genes such as POLR2G, MXRA7 and UBA52 involved in biological processes that may lead to the establishment and maintenance of endometriotic implants. This genomic imbalance may affect genes in which dysregulation impacts both eutopic and ectopic endometrium.

Hibridização reversa e sequenciamento na genotipagem do vírus da hepatite C / Reverse hybridization and sequencing for genotyping the hepatitis C virus

INTRODUÇÃO: Os métodos de genotipagem do vírus da hepatite C têm sido muito discutidos. O objetivo deste trabalho foi comparar as metodologias de hibridização reversa e sequenciamento direto para a genotipagem do vírus da hepatite C. MÉTODOS: Noventa e uma amostras de plasma de pacientes assistidos na Faculdade de Medicina de Botucatu da Universidade Estadual Paulista foram utilizadas. A genotipagem por hibridização reversa foi realizada utilizando o kit comercial INNO-LiPA® v.1.0. O sequenciamento direto foi efetuado em sequenciador automático utilizando protocolos in house. RESULTADOS: A genotipagem por sequenciamento direto mostrou-se eficiente na resolução dos resultados inconclusivos pelo kit comercial. O kit mostrou resultados errôneos em relação à subtipagem viral. Além disso, a genotipagem por sequenciamento direto revelou um erro do kit com relação à determinação genotípica questionando a eficiência do método também para a identificação do genótipo viral. CONCLUSÕES: A genotipagem realizada por meio de sequenciamento direto permite uma maior acurácia na classificação viral quando comparada à hibridização reversa.

INTRODUCTION: The methods for genotyping the hepatitis C virus have been much discussed. The aim of this study was to compare the methodologies of reverse hybridization and direct sequencing for genotyping the hepatitis C virus. METHODS: Ninety-one plasma samples from patients attended at the Botucatu Medical School, São Paulo State University, were used. Genotyping by reverse hybridization was performed using the INNO-LiPA® v.1.0 commercial kit. Direct sequencing was performed in an automated sequencer using in-house protocols. RESULTS: Genotyping by direct sequencing was shown to be efficient for resolving cases that had remained inconclusive after using the commercial kit. The kit showed erroneous results in relation to virus subtyping. Moreover, direct sequencing revealed an error of the kit regarding the genotypic determination, thereby raising doubts about the efficiency of reverse hybridization for identifying the virus genotype. CONCLUSIONS: Genotyping by direct sequencing allowed greater accuracy of virus classification than did reverse hybridization.

Chromosomal imbalances detected in primary bone tumors by comparative genomic hybridization and interphase fluorescence in situ hybridization

We applied a combination of comparative genomic hybridization (CGH) and fluorescence in situ hybridization (FISH), to characterize the genetic aberrations in three osteosarcomas (OS) and one Ewing's sarcoma. CGH identified recurrent chromosomal losses at 10p14-pter and gains at 8q22.3-24.1 in OS. Interphase FISH allowed to confirm 8q gain in two cases. A high amplification level of 11q12-qter was detected in one OS. The Ewing's sarcoma showed gain at 1p32-36.1 as the sole chromosome alteration. These studies demonstrate the value of molecular cytogenetic methods in the characterization of recurrent genomic alterations in bone tumor tissue

Genomas de microoganismos y diagnóstico molecular / Genome of microorganisms and molecular diagnosis

En este artículo se exponen los principales descubrimientos de la nueva ciencia denominada genómicas y sus principales repercusiones para el diagnóstico microbiológico, tales como la nueva tecnología de los ADN chips

Aplicación de las técnicas de biología molecular en el estudio del genoma humano y en el diagnóstico de las enfermedades hereditarias / Molecular techniques in the study of the human genome and for diagnosis of hereditary diseases

El advenimiento de las técnicas de DNA recombinante abrió una nueva era en los estudios genéticos. Por primera vez se hizo posible aislar, amplificar e incluso manipular segmentos de DNA de genes individuales. Estos métodos, junto con herramientas poderosas como los métodos de secuenciación, reacción en cadena de la polimerasa y el chips de DNA, han permitido el conocimiento de la estructura, función y regulación de los genes. Actualmente, las técnicas del DNA recombinante tienen muchas aplicaciones importantes, entre las que destacan la localización y clonación de genes responsables de enfermedades, lo que permite su diagnóstico molecular y la identificación precisa de individuos a través de sus huellas genómicas. Además, esta metodología ha permitido la producción comercial de genes y proteínas mediante ingeniería genética para su empleo en medicina y la creación de animales transgénicos

Occurence of citrus viroids in Costa Rica

A survey for citrus viroids was conducted in the major citrus commercial growing areas in Costa Rica. Screening of 36 sweet orange and 12 lemon trees resulted in the detection of members of four of the five citrus viroid groups as determined by nucleic acid hybridization using specific RNA probes and polymerase chain reaction (PCR) using specific oligonucleotide primers. CEVd, CVd-IIa, CVD-IIb and CVd-III viroids were found to be widespread in the three main regions of commercial citrus production. CVd-Ib was only found in lemon in Nicoya

DNA polymorphisms identified by six X-chromosome probes, linked to genetic diseases, in a Spanish population

Usando seis diferentes probes de cromossomo X, estimou-se a freqüência de polimorfismo de comprimento de fragmento de restriçäo (RFLP) com endonucleases de restriçäo em pessoas näo parentes, em uma populaçäo espanhola de Valência. As freqüências de alelos foram semelhantes às de outras populaçöes européias, em particular francesas e turcas. Um alto grau de polimorfismo foi encontrado para todos os marcadores, sendo que a freqüência do alelo raro variou de 0,484 a 0,357 e um alto nível de heterozigose dos marcadores L1.28, 754, OTC e p58.1 foi encontrado nesta populaçäo, confirmando sua utilidade para a diagnose.

A simplified method for the non-radioactive detection of hybridized nucleic acids

No presente trabalho estudaram-se 4 protocolos diferentes de detecçäo näo radioativa de ácidos nucleicos utilizando sonda genética biotinilada. A razäo deste trabalho säo as inúmeras dificuldades encontradas na padronizaçäo dos ensaios de hibridizaçäo utilizando o método quimioluminiscência principalmente devido ao grande background presente nos filtros. Devido às grandes vantagens que a utilizaçäo de sondas näo radioativas nos oferece, utilizando DNA plasmídico pBR-322, descreveram-se uma metodologia simples, reprodutível e de baixo custo de hibridizaçäo molecular utilizando a técnica de quimioluminiscência

Identificación de cromosomas sexuales marcadores mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH) / Identification of sex chomosome markers using fluorescence in situ hybridization (FISH)

Del 6 al 15 de los casos son síndrome de Turner presentan un cariotipo en mosaico con una línea 45,X, y otra con un pequeño cromosoma sexual marcador de origen no determinado, que puede ser un anillo o un fragmento céntrico. La identificación de su origen, que frecuentemente se dificulta por la falta de resolución de las técnicas citogenéticas y la variabilidad en el fenotipo clínico , es de vital importancia ya que, si provienen de un cromosoma Y, el paciente tiene un riesgo elevado de desarrollar gonadoblastoma. El objetivo del presente trabajo fue determinar el origen de pequeños cromosomas sexuales marcadores mediante la técnica de hibridación in situ con fluorescencia (FISH). Se estudiaron ocho pacientes: siete mostraban fenotipo Turner con genitales externos femeninos, y la octava tenía talla baja con ambigüedad de genitales. En todos los casos se identificó, en el cariotipo de sangre periférica, un mosaico con una línea celular que presentaba un cromosoma sexual marcador; en tres se corroboró el mosaico en fibroblastos. Para la técnica de FISH se utilizaron sondas de DNA marcadas con biotina, con secuencias complementarias a la región centroamérica alfa satélite de los cromosomas X y Y. Con la sonda alfa satélite del X, se estableció que el cromosoma marcador provenía del X en siete pacientes. En la paciente con genitales ambiguos, se determinó que el marcador derivaba del cromosoma Y. Consecuentemenete la técnica FISH fue capaz de identificar el origen de los cromosomas sexuales marcadores en las ocho pacientes

Detección del papilomavirus humano en ADN de tejido normal y lesiones premalignas del cérvix por hibridación molecular / Identification of human papilloma virus in DNA of normal tissue and precursor lesions of uterine cervix by molecular hybridization

Se analizaron 64 muestras de ADN obtenido de tejido histológicamente normal del cérvix y de lesiones tempranas del cáncer cervical por hibridación dot-blot, para detectar la presencia de papilomavirus humano(PVH). Utilizando ADN de controles adecuados y sondas específicas, detectamos la infección por PVH en 39 por ciento(25 de 64) de los casos; mientras que 61 por ciento (39 de 64) resultó negativo a PVH. Se detectó PVH del grupo de ®bajo riesgo¼ (tipo 6/11) en un 80 por ciento (20 de 25) de las muestras de ADN; mientras que un 8 por ciento (2 de 25) fue positivo a PVH del grupo de ®alto riesgo¼ (tipo 16/18). Además, encontramos 12 por ciento (3 de 25) de las muestras positivas a ambos grupos de virus

Detección y tipificación del virus papiloma humano en lesiones laríngeas con técnica de hibridación molecular in situ / Detection and typification of human papilloma virus in laryngeal lesions with the technique of molecular hybridization in situ

Se ensayó la técnica de hibridación molecular in situ en lesiones papilomatosas de la laringe, con el objetivo de detectar material genético de virus papiloma humano (VPH), identificar los tipos virales involucrados en la infección, establecer relación de diagnóstico histológico con el virológico y verificar si, a determinados cambios histopatológicos, se asocian genotipos específicos. En ocho pacientes adultos portadores de papilomatosis laríngea se revisaron, retrospectivamente, aspectos clínicos y del tejido de biopsia. Se analizaron histopatológicamente las muestras, verificando la existencia de displasia y actividad viral, y se sometieron los tejidos al estudio de hibridación molecular de ácidos nucleicos in situ. Estos aspectos se realizaron independientemente siendo por tanto un estudio doble ciego. Detectamos genotipos virales en 7 de los 8 pacientes. Tres de ellos fueron positivos para los tipos 6-11 y se asociaron a grados de displasia leves y signos de actividad viral evidente. Cuatro pacientes fueron positivos para los tipos 16-18 y presentaron grados de displasia moderada y severa con pocos signos de actividad viral. Los resultados inducen a pensar que los genotipos 6-11 se asocian a lesiones de pronóstico benigno y los 16-18 a lesiones que podrían resultar malignas debiendo considerarse la infecciones por VPH en la laringe, especialmente las producidas por subtipos 16-18, como de riesgo, dado que estas serian cofactores carcinogenéticos

Papilomavirus humano en pacientes con cáncer cervicouterino: en el Instituto Nacional de Cancerología / Human papilloma virus in patients with neoplasm cervix uterine in the Instituto Nacional de Cancerologia

La utilización de técnicas de ingeniería genética y biología molecular ha permitido aislar e identificar diferentes tipos virales asociados a diversas enfermedades. Tal es el caso del papilomavirus humano (PVH) al cual se ha mencionado como el candidato etiológico del cáncer cervicouterino (CaCu). En el presente trabajo se analizó la presencia de PVH tipos 6, 11, 16 y 18 en ADN de tejido obtenido en biopsias de un grupo de 70 pacientes del Instituto Nacional de Cancerología (INCan), con diagnóstico histológico de CaCu invasor. Mediante hibridación Southern-blot, se observó que 17 (24.3 por ciento) casos fueron positivos para secuencias de PVH 16 y en siete (10 por ciento) para PVH 18; en estas muestras no fueron detectadas secuencias para PVH 6 y 11. Los resultados obtenidos sugieren que los PVH 16 y 18 son poco frecuentes en nuestra población hospitalaria. Es necesario realizar estudios con otros tipos virales asociados a CaCu, como los tipos 31, 33 y 35, a fin de ampliar el espectro de detección de PVH. También es necesario continuar con la identificación de PVH con otras técnicas de biología molecular --como la reacciónde polimesasa en cadena-- para conocer mejor la distribución, la frecuencia y el tipo de infección de PVH en pacientes que acuden al INCan con CaCu.

Detección de ADN de papilomavirus humano en lesiones orales y en tejido oral normal / Presence of DNA in human papilloma virus oral lesions, normal oral tissue

En este trabajo se reporta la presencia de ADN del papilomavirus humano (PVH) tipos 6, 11, 16 y 18 (frecuentes en lesiones genitales) en lesiones premalignas (10 eritroplasias y 11 leucoplasias), malignas (10 carcinomas) y en 10 muestras de tejido oral normal. La identificación de las secuencias de ADN se realizó por la técnica de hibridización de ácidos nucleicos variante dot blot, utilizando marcaje radioactivo, a partir de muestras de biopsia.

Caracterización de la amplificación génica de un segmento de 294 bases del genoma de mycobacterium tuberculosis / Characterization of genic amplification of a segment of 294 bases of mycobacterium tuberculosis genoma

Se presentan los resultados de una prueba diagnóstica novedosa, basada en la amplificación de una secuencia nucleótida conocida de un ADN blanco. La reacción de amplificación génica (PCR), descrita en este trabajo, permite una amplificación * 10 elevado a 6 -veces un segmento de 294 bp de un gene que codifica a un antígeno de 65 KDa- correspondiente a una proteína de respuesta al estrés térmico, presente en Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis BCG. Esta reacción requiere grandes cantidades de ADN blanco, pero con la técnica utilizada fue posible detectar amplificación comenzando con 10 elevado a -12 g de ADN; cantidad que corresponde a 10-100 micobacterias/equivalentes ADN. Este nivel detectado representa un mejoramiento respecto a la tinción Ziehl-Neelsen, el cual necesita sobre 10.000 micobacterias para ser leído como positivo. La concentración de Mg elevado a +2 es crítica en la reacción, la cual corresponde a 3-5 mM. El análisis de la secuencia muestra que la amplificación de ésta es comparable a la secuencia localizada entre las posiciones 781-1075 del gene 65 KDa. Se realizaron pruebas específicas que demostraron que la señal de amplificación es posible de encontrar con ADN obtenido de M. tuberculosis y M. bovis BCG. Con otras micobacterias la señal de amplificación es muy baja y equivalente a aquéllas encontradas con ADN micobacterial no relacionado. La reacción fue probada con cuatro muestras clínicas, las cuales fueron positivas para la presentación de micobacterias; en tres de ellas se encontró el segmento amplificado 294 bp. Continúan desarrollándose ensayos de sensibilidad y especificidad en muestras clínicas

Uso de sondas moleculares en la detección de infecciones virales / Use of molecular probes in the detection of viral infections

Diversos métodos son utilizados para la detección y diagnóstico de una enfermedad viral, éstos se basan en la detección de componentes estructurales del virus, tales como antígenos o material gemónico del virus. Para la detección de genes o genomas virales en material biológico infectado se utilizan sondas moleculares, producidas a partir de partículas virales o DNA recombinante. Se describen la obtención y caracterización de sondas genéticas, los principales métodos de marcación, así como también las técnicas de hibridación más utilizadas. Las sondas genéticas aportan hoy en día una herramienta importante para el diagnóstico y tipificación viral, así como también estudio de la patogenia, biología y estudios epidemiológicos a nivel molecular